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[응용자료]시타글립틴/메트포르민 복합제에서의 NTTP 불순물 정량 분석
Nitrosamine은 의약품 제조나 저장 과정에서 생성될 수 있는 불순물로, 일부는 발암 가능성이 있어 규제기관의 주목을 받고 있습니다. 특히 NDSRI(Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities)는 API(유효성분)와 구조적으로 유사하며, 그 자체 혹은 분해산물로부터 발생할 수 있습니다. 최근 sitagliptin 제제에서 N-nitroso sitagliptin (NTTP)이 검출되어 규제 이슈가 되었으며, EMA는 하루 섭취 허용량을 37 ng/day로 제한하고 있습니다.
본 응용 자료에서는 Agilent 1290 Infinity II LC와 Agilent 6475 삼중 사중극자 질량분석기(LC/TQ)를 이용하여 NTTP를 극미량 수준까지 정량하는 고감도 분석법을 소개합니다. 이 방법은 높은 선택성과 정밀도를 제공하며, 신약 개발 초기부터 품질 관리 및 규제 대응까지 활용할 수 있습니다.
| 구분 | 내용 |
|---|---|
| 시료 | Sitagliptin/metformin 복합 정제 |
| 시료 보관 | 시료 여러 개를 분석하여 평균 정량 계산 |
| 시료 채취 | Sitagliptin 기준 15 mg 함량환산용 정량에 취함 |
| 추출 용매 | 100% Methanol (실험에선 diluent로 사용됨) |
| 추출 방법 | Vortex 1분 → Rotospin Shaker 40분간 흔들기 |
| 원심분리 | 4,000 rpm, 10℃, 20분간 |
| 여과 | 0.22 μm PVDF 시린지 필터 사용 |
| 주입 전 처리 | 필터링된 상등액을 LC용 vial에 옮김 |
| 항목 | 설정값 |
|---|---|
| LC 컬럼 | Biphenyl, 4.6 × 150 mm, 2.7 μm |
| 컬럼 온도 | 50℃ |
| 이동상 A | 0.1% Formic acid in water |
| 이동상 B | 0.1% Formic acid in methanol |
| Flow rate | 0.5 mL/min |
| 주입량 | 10 μL |
| 샘플 희석액 | 100% Methanol |
| 검출 파장 | 230 nm (Sitagliptin 확인용) |
| 이온화 방식 | APCI (양이온 모드) |
| MS 조건 | Fragmentor: 80 V / CE: 7 V / Precursor→Product: 222→192 |
| S/N 기준 | LOD > 30:1 / LLOQ > 300:1 / LOQ > 600:1 |
NTTP 표준물질(1.3 ng/mL)에 대한 대표 MRM 크로마토그램과 메트포르민 및 시타글립틴에 대한 DAD 크로마토그램
확장형 정제 제형(Extended-release tablet) 내에서 NTTP 불순물과 API 간의 명확한 분리가 확인
본 연구에서는 확장형 정제 제형에서 N-nitroso sitagliptin (NTTP) 불순물을 정량하기 위한 고감도 및 고선택성 분석법이 개발되었다. 해당 분석법은 Agilent 1290 Infinity II 액체 크로마토그래프와 Agilent 6475 삼중 사중극자 질량분석기(LC/TQ)를 활용하여, 분석의 정밀도, 정확도, 재현성을 모두 충족하였다.
해당 방법은 0.04 ~ 1.3 ng/mL 범위에서 우수한 직선성(R² > 0.999)을 보였으며, LOQ 및 스펙 한계 수준에서도 상대표준편차(RSD)가 5% 이하로 나타나 우수한 정량 신뢰도를 입증하였다. 또한, 검출한계는 LOD 0.008 ng/mL (S/N > 30:1), LLOQ 0.04 ng/mL (S/N > 300:1), LOQ 0.088 ng/mL (S/N > 600:1)로 확인되어 매우 높은 민감도를 확보하였다.
이 분석법은 정제 제형 내에서 API와 NTTP 불순물을 명확히 분리할 수 있었으며, 스파이크 시료에 대한 회수율도 ±20% 이내로 확보되어 루틴 분석에 적용 가능한 재현성을 입증하였다. 또한 본 방법은 미국 FDA의 최신 nitrosamine 관리 가이드라인을 만족하는 수준의 민감도와 선택성을 보이며, 의약품 내 NDSRI 계열 불순물 분석에 효과적인 도구로 활용 가능하다.
