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[응용자료] Agilent AdvanceBio SEC 컬럼을 이용한 Virus-Like Particles(VLPs) 분석
Agilent AdvanceBio SEC 컬럼을 이용: Virus-Like Particles(VLPs) 분석
VLPs 분석은 백신 및 치료제 개발, 제품 품질 평가, 생산 공정 최적화, 그리고 안전성 평가 등
다양한 측면에서 중요한 역할을 합니다.
이 자료에서는 AdvanceBio SEC 1000 Å, 4.6 × 300 mm, 2.7 μm (p/n PL1580-5302)컬럼을 이용하여
VLPs 을 디텍터 종류, 컬럼의 Batch 별로 분석한 결과를 비교하였습니다.
1. Method conditions
| HPLC Conditions | |
|---|---|
| Column | Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å, 4.6 × 300 mm, 2.7 μm (p/n PL1580-5302) |
| Mobile Phase | 50 mM Sodium phosphate + 400 mM NaCl, pH 7.2 |
| Flow Rate | 0.35 mL/min |
| Column Temperature | Room temperature |
| Injection Volume | 1 μL |
| Detection | UV, 280 nm, FLD excitation 280 nm, emission 348 nm |
| Run Time | 15 min |
| HPLC System | Agilent 1290 Infinity II Bio LC system with binary high-speed pump |
2. Result
형광검출기 (FLD) 가 VLPs 분석에서 더 높은 반응을 보인다는 보고가 있지만
이 실험결과에서는 충분한 시료양이 있었기 때문에 220nm에서도 충분한 민감도를 볼 수 있었습니다.
또한 aggregate와 monomer를 분리 하는데에도 성공하였습니다.
그림 1 . (A) 1 µL의 HPV-16 VLP 샘플을 사용한 실험에서, UV 280 nm (파란색 선)과 UV 220 nm (빨간색 선)에서의
크로마토그래피 결과를 겹쳐서 보여줍니다.
(B) 1 µL의 HPV-16 VLP 샘플을 280 nm에서 UV 크로마토그래피로 분석한 결과입니다.
(C) 1 µL의 HPV-16 VLP 샘플을 348 nm에서 방출되는 형광 크로마토그래피 결과입니다.
<표1. Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å Column Injection Test>
| Injection | RT Monomer | % HMW | % Monomer | Resolution | Tailing Factor |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.00 | 27.07 | 72.93 | 1.64 | 1.10 |
| 2 | 8.99 | 27.11 | 72.88 | 1.63 | 1.11 |
| 3 | 8.99 | 27.01 | 72.99 | 1.64 | 1.12 |
| 4 | 8.99 | 26.57 | 73.35 | 1.63 | 1.13 |
| 5 | 8.99 | 26.87 | 73.13 | 1.63 | 1.13 |
| Average (n = 5) | 8.99 | 26.93 | 73.06 | 1.63 | 1.12 |
| Standard Deviation | 8.99 | 0.2 | 0.17 | 0.01 | 0.01 |
| %RSD | 0.01% | 0.74% | 0.23% | 0.38% | 1.07% |
HPV-16 VLP 샘플을 같은 컬럼에 여러 번(5번) 주입해서 주입할 때마다 결과가 일정한지 확인하였습니다.
결과는 일정하게 나왔으며, 새로운 이동상에 컬럼을 맞추기 위해 10배 컬럼 볼륨을 사용한 것 외에는 특별한 조건이 필요하지 않았습니다.
표 1에 따르면, 상대 표준 편차(RSD)는 0%였고, 총 피크 면적의 RSD는 2% 미만이었습니다.
<그림 2. HPV-16을 서로 다른 배치 컬럼으로 분석했을때의 형광 크로마토그램>
컬럼 성능과 견고성을 더 평가하기 위해 1,000 Å media 제조 batch 4군데의 제품을 비교평가하였습니다. 그림 2에서 보면 테스트 샘플은 유지 시간, % monomer, 총 회수율, monomer peak 와 Resolution ( Aggregate 사이) 분해능, mononer peak의 tailing factor와 같은 다양한 매개변수에서 10% 미만의 RSD로 매우 높은 재현성을 보였습니다.
| RT Monomer(min) | %HMW | %Monomer | Resolution | Tailing Factor | |
|---|---|---|---|---|---|
| AdvanceBio SEC 1000 Å | 8.89 | 20.86 | 79.14 | 1.62 | 1.09 |
| RT Monomer(min) | %HMW | %Monomer | Resolution | Tailing Factor | |
|---|---|---|---|---|---|
| Bio SEC-5 1000 Å | 8.10 | 18.40 | 81.60 | 1.15 | 1.0 |
<그림 3. HPV-16을 Agilent Bio SEC-5 1000 Å 컬럼 (A)과 Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å 컬럼 (B)으로 분석했을때의 형광 크로마토그램>
HPV-16을 Agilent Bio SEC-5 1000 Å 컬럼 (A)과 Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å (B)컬럼로 분석한 결과를 비교하였습니다. 새로 개발된 AdvanceBio SEC 컬럼은 더 작은 입자로 인해 aggregate 와 monomer peak 사이의 분해능이 더 좋았습니다. 또한, 더 많은 pore로 인해 더 많은 aggregate와 dimer사이가 더 잘 분리되었습니다. monomer peak도 Agilent Bio SEC-5 컬럼보다 AdvanceBio SEC 컬럼에서 더 좁았습니다.
Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å
| 1. wide pore size | 1,000 Å의 wide pore size는 20~80 nm 크기 범위 내의 VLP 샘플의 집합체(aggregate) 및 조각 분석에 적합합니다. |
|---|---|
| 2. 작은 Particle size | 2.7 μm의 작은 입자 크기는 높은 resolution 과 분리 능력을 제공하여 aggregate 를 monomer VLP로부터 분리하고 해결할 수 있습니다. |
| 3. 높은 재현성 | 컬럼의 재현성이 우수하여 여러 번의 주입에도 일관된 성능을 보여줍니다. |
| 4. 높은 분리 능력 | 더 많은 고분자량 집합체를 포함하고 더 나은 분해능을 제공하여 우수한 분리를 가능하게 합니다. |
| 5. 향상된 샘플 회수 | 샘플 회수가 우수하여 샘플 손실을 최소화하고 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. |
| 6. 다양한 응용 | 다양한 바이러스 유사 입자(VLPs) 분석을 위한 다양한 응용에 적합합니다. |
이러한 점들은 Agilent AdvanceBio SEC 1000 Å 컬럼을 사용하는 것이 VLPs 분석에 매우 효과적이고 신뢰할 수 있다는 것을 보여줍니다.
* 참고 문헌
Agilent : Robust Wide Pore Size Exclusion Columns for Virus-Like Particles (VLPs) Analysis / 5994-7427en
